Wybuchowe wyniki badań z wirusem "Marburg" w tle
Ukierunkowane dostarczanie nanoarkuszów o zmniejszonej zawartości tlenku grafenu za pomocą wielofunkcyjnych nanopęcherzyków ultradźwiękowych do wizualizacji i ulepszonej terapii fototermicznej
|
OD TŁUMACZA O S T R Z E Ż E N I E |
 |
|
Przedstawiony poniżej artykuł został opublikowany na łamach International Journal of Nanomedicine nr 2018; 13: 7859–7872 z 22 listopada 2018 roku. Opisuje on badania oraz ich wyniki, które mogą mieć i będą mieć dalekosiężne skutki – niestety – bardzo dotkliwe, a wręcz mordercze. Opisana w nich metoda obrazowania oraz terapii fototermicznej poprzez ukierunkowane dostarczanie do komórek rakowych nanoarkuszów o zmniejszonej zwartości tlenku grafenu (rGO) za pomocą wielofunkcyjnych nanopęcherzyków ultradźwiękowych może zostać wykorzystane nie koniecznie do celów diagnostycznych. Biorąc pod uwagę, iż omawiane w niniejszej pracy substancje i preparaty (glikol polietylenowy oraz grafen) występują w tzw. szczepionkach mRNA i szczepionkach wektorowych przeciwko COVID-19, należy sobie zadać pytanie, czy znalazły się tam przypadkowo, czy też ich dobór był celowo zamierzony. Z treści niniejszego artykułu wynika, że pod wpływem wysokich temperatur, grafen ma właściwości wybuchowe. Nagrzanie kryształków grafenu można również osiągnąć poprzez zwiększenie częstotliwości w sieci 5G do 26 GHz. W takim przypadku należy zapytać, czy „podkręcenie” częstotliwości może spowodować, że znajdujący się w komórkach ludzkich grafen oraz glikol polietylenowy wraz z białkiem S (spike) będą swego rodzaju bombą, zaś działanie tego mechanizmu może do złudzenia przypominać gorączkę krwotoczną (choroba Marburga), o której to coraz częściej słychać, jako o przyczynie nowej, grożącej ludzkości pandemii? Jaki to mechanizm? Pod wpływem działania fal elektromagnetycznych wysokiej częstotliwości za pośrednictwem sieci 5G w komórkach ludzkich osób, które przyjęły preparat może dochodzić do miejscowego wzrostu temperatury, w wyniku czego skażone grafenem i glikolem polietylenowym komórki zaczną eksplodować, powodując krwotok wewnętrzny, poprzedzony lub któremu będzie towarzyszyła wysoka gorączka. W takim przebiegu „choroby”, gdzie do uszkodzenia ciała zachodzi na poziomie komórkowym, należy przypuszczać, iż śmiertelność wśród „zakażonych” będzie bardzo wysoka, zaś przyczyny określane przez lekarzy i oficjalne media jako biologiczne (wirus Marburg) „nie będą budziły jakichkolwiek wątpliwości”. Być może dopiero szczegółowa autopsja mikroskopowa - na poziomie komórkowym osoby zmarłej - pozwoli uzyskać właściwą diagnozę i określić faktyczne przyczyny śmierci. Życzę refleksji i owocnej lektury, chociaż zdaję sobie sprawę, że przebrnięcie przez nią dla przeciętnego czytelnika, który niewiele ma wspólnego z medycyną, chemią i fizyką, może stanowić problem. Zaręczam jednak, że warto. |
|
International Journal of Nanomedicine. 2018; 13: 7859–7872.
opublikowano online: 22 listopada 201 roku
doi: 10.2147/IJN.S181268
Autorzy: Zhao Liu,1,* Jia Zhang,2,* Yuhang Tian,1 Lei Zhang,1 Xue Han,1 Qiucheng Wang,1 and Wen Cheng1
Informacja o autorach:
1. Department of Ultrasound, Harbin Medical University Cancer Hospital, Nangang District, Harbin 150080, Chiny, moc.oohay@96newgnehc
2. Główne Laboratorium Wytwarzania Mikrosystemów i Mikrostruktur, Ministerstwo Edukacji, Harbin Institute of Technology, Harbin 150080, Chiny
Korespondencja: Wen Cheng, Department of Ultrasound, Harbin Medical University Cancer Hospital, 150 Haping Road, Nangang District, Harbin 150080, China, Tel/fax +86 451 8571 8396, Email moc.oohay@96newgnehc
* Ci autorzy w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy
Nota o prawach autorskich:
Copyright © 2018 Liu i in. Praca ta jest opublikowana i licencjonowana przez Dove Medical Press Limited. Pełne warunki tej licencji są dostępne na stronie https://www.dovepress.com/terms.php i zawierają licencję Creative Commons Attribution – Non Commercial (unported, v3.0) (http://creativecommons.org/licenses/ by-nc/3.0/).
Uzyskując dostęp do pracy, niniejszym akceptujesz Warunki. Niekomercyjne wykorzystanie utworu jest dozwolone bez dalszego zezwolenia ze strony Dove Medical Press Limited, pod warunkiem, że utwór jest właściwie przypisany.
|
Niniejszy artykuł został poprawiony. Zobacz: Int. J. Nanomedicine 2019; 14:2449. Publikacja była cytowana w innych artykułach w PMC. |
Tłumaczenie:W rzeczy samej
Streszczenie:
Ultradźwiękowe obrazowanie molekularne jako obiecująca strategia, która obejmowała zastosowanie molekularnie ukierunkowanych środków kontrastowych, łączyła zalety ultrasonografii ze wzmocnieniem kontrastowym z fototermicznym efektem zredukowanego tlenku grafenu (rGO).
Metody i wyniki:
Proteoglikan glipikan-3 siarczanu heparyny (GPC3) jest potencjalnym celem molekularnym raka wątrobowokomórkowego (HCC). W tym badaniu kowalencyjnie połączyliśmy biotynylowane przeciwciało GPC3 z PEGylowanym nano-rGO w celu uzyskania zmodyfikowanego GPC3 rGO-PEG (rGO-GPC3), a następnie połączyliśmy rGO-GPC3 z awidinylowanymi nanopęcherzykami (NB) przy użyciu systemu biotyna-awidyna w celu przygotowania NB- GPC3-rGO o działaniu fototermicznym i dyspergowalności, rozpuszczalność w środowisku fizjologicznym. W wyniku polimeryzacji układu biotyna-awidyna średnia wielkość kompleksu NBs-GPC3-rGO wynosiła 700,4±52,9 nm. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) wykazał NBs-GPC3-rGO przyłączone do komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego HepG2. Technologia niszczenia nanopęcherzyków ukierunkowanych na ultradźwięki (UTND) wykorzystuje energię fizyczną ekspozycji na ultradźwięki do poprawy dostarczania rGO do celowanych komórek. W porównaniu z innymi grupami kontrolnymi, najwyższą skuteczność niszczenia nanopęcherzyków NBs-GPC3-rGO przypisano efektowi sekcji rGO na UTND. Jest to efekt dodatniego sprzężenia zwrotnego, który prowadzi do wzrostu stężenia rGO wokół komórki HepG2. Tak więc NBs-GPC3-rGO przy użyciu naświetlania UTND i bliskiej podczerwieni (NIR) skutkowały żywotnością komórek w ciągu 24 godzin, 48 godzin, 72 godzin niższą niż w innych leczonych grupach.
Wnioski:
W ramach omawianych prac ustalono, że NBs-GPC3-rGO jest ultradźwiękowym środkiem fototermicznym ze względu na jego odpowiedni rozmiar, zdolność obrazowania i wydajność fototermiczną w wizualnej terapii fototermicznej in vitro. Słowa kluczowe: zredukowany tlenek grafenu, ultradźwiękowe niszczenie nanopęcherzyków, glipikan-3, komórka HepG2, terapia fototermiczna.
Wprowadzenie:
Ze względu na wysoki odsetek nawrotów i przerzutów nowotwór wątrobowokomórkowy (HCC) jest szóstym najczęstszym nowotworem złośliwym na świecie.1 Poczyniono do tej pory znaczne postępy, zarówno w terapiach chirurgicznych, jak i niechirurgicznych, jednak rokowanie u pacjentów nadal jest bardzo złe.1,2 Ze względu na skłonność do przerzutów, 5-letni wskaźnik przeżycia pacjentów z HCC jest nadal bardzo niski, a około 600 000 pacjentów z HCC umiera każdego roku.
Metoda terapeutyczna ma duże znaczenie. Terapia fototermiczna (PTT), nieinwazyjna, wysoce selektywna i potencjalnie skuteczna terapia przeciwnowotworowa, przyciągnęła w ostatnich latach znaczne zainteresowanie.4,5 W typowym PTT materiały fotouczulające są wykorzystywane przez komórki do generowania miejscowego wzrostu temperatury po absorpcji światła. co prowadzi do fotoablacji komórek rakowych i późniejszej śmierci komórki. Z tego powodu materiały fotouczulające muszą charakteryzować się wysoką selektywnością wobec komórek nowotworowych, aby uniknąć zabijania zdrowych komórek.6 Ponadto materiał powinien być w stanie silnie absorbować światło bliskiej podczerwieni (NIR)7, co jest uważane za optymalne okienko optyczne dla PTT dzięki wysokiej przezroczystości tkanki biologicznej, krwi i wody.8,9
Ostatnio grafen przyciągnął dużą uwagę w wielu dziedzinach ze względu na swoje doskonałe właściwości.10-17 W biomedycynie wysoka powierzchnia właściwa i wielofunkcyjność pozwalają na szerokie zastosowanie grafenu jako nośnika zarówno leków, jak i genów.18-21 Ponadto wysoka czułość fototermiczna i niska toksyczność zredukowanego nanometrycznego tlenku grafenu (nano-rGO) sprawiają, że jest to obiecujący środek fotoabsorbujący do PTT.6 Niemniej jednak obecna ocena wydajności w dużej mierze opiera się na technikach obrazowania, takich jak CT, MRI i obrazowanie fluorescencyjne, które należy przeprowadzić kilka godzin do dni po leczeniu PTT. Co gorsza, dotychczasowe wyniki wskazują, że rGO nie ma możliwości obrazowania podczas procesu ablacji guza. W efekcie wciąż brakuje materiałów fotouczulających, które posiadają możliwości zarówno transportu, jak i obrazowania w czasie rzeczywistym.
Ultradźwięki ze wzmocnieniem kontrastowym jako zaawansowana technologia są od lat stosowane u pacjentów z HCC w wielu krajach. W ostatnich dziesięcioleciach ultrasonograficzne obrazowanie molekularne oparte na zaletach ultrasonografii ze wzmocnieniem kontrastowym przyciągnęło znaczną uwagę w badaniach przedklinicznych nad diagnostyką i terapią HCC.22,23 Jest to obiecująca strategia obrazowania o ogromnym potencjale poprawy dokładności diagnostycznej w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem w wykrywaniu HCC.24 Wraz z szybkim rozwojem bionanotechnologii ultradźwiękowego obrazowania molekularnego, nanopęcherzyk (NB) stał się ultrasonograficznym środkiem kontrastowym. W rezultacie NB mogą uzyskać dostęp do przestrzeni pozanaczyniowej i zapewniają wyjątkowe korzyści dla celowanego, specyficznego obrazowania ultrasonograficznego ze względu na ich mały rozmiar, stabilność oraz nowe właściwości fizyczne i powierzchniowe.22 Ostatnio niszczenie NB ukierunkowane na ultradźwięki (UTND) jako bezpieczna i skuteczna metoda, był w stanie niszczyć środki kontrastowe w miejscach napromieniowanych ultradźwiękami, co odgrywa istotną rolę w poprawie skutecznego dostarczania egzogennych genów i leków w sposób nieinwazyjny poprzez sonoporację NB.22,23,25,26 W rezultacie nowym środkiem kontrastowym można zsyntetyzować połączenie arkuszy rGO z NB, które mają zarówno możliwości ultradźwiękowego obrazowania molekularnego, jak i zdolności fototermiczne, co pozwala na monitorowanie procesu PTT w czasie rzeczywistym.
W niniejszej pracy zsyntetyzowaliśmy nową nanocząstkę teranostyczną zawierającą nano-rGO-enkapsulowane NBs, która może osiągnąć wizualizację i wzmocnić efekt PTT. W celu ukierunkowania środków kontrastowych, kompozycja została powiązana z nowym biomarkerem HCC, proteoglikanem siarczanu heparyny glypican-3 (GPC3), który ulega wysokiej ekspresji w większości komórek nowotworowych pacjentów z HCC, ale nie w normalnych tkankach dorosłych.27-33 Tak więc, biorąc pod uwagę specyficzny dla HCC charakter ekspresji GPC3, postawiliśmy hipotezę, że ultrasonograficzne obrazowanie molekularne przy użyciu NBs ukierunkowanych na GPC3 pozwoli na transfekcję arkuszy rGO do błony komórkowej HCC i wysoce dokładne monitorowanie procesu PTT w czasie rzeczywistym. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, zastosowanie NBs pokrytych GPC3 i obciążonych rGO jako ultradźwiękowego czynnika fototermicznego skierowanego na komórki HCC nie zostało nigdzie indziej opisane i jest uważane za nowatorskie.
Sekcja Eksperymentalna
Materiały i proces syntezy
Synteza awidinylowanych NB:
System biotyna-awidyna może być wykorzystany jako łącznik do integracji dużych ilości środków znakowanych biotyną z awidynylowanymi NB, ze względu na jego wyjątkowe właściwości, które są niezwykle stabilne w szerokim zakresie temperatur i wartości pH.34-36 Awidinylowane NB zostały zsyntetyzowane w zmodyfikowanym procesie emulgowania.37,38 W skrócie, trzy typy liposomów, 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC); 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000); i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[biotynyl (glikol polietylenowy) -2000] (DSPE-PEG2000-biotyna) zakupiono od Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) i zmieszano w stosunek molowy 9:0,5:0,5. Pewną ilość fosfolipidów rozpuszczono w rozpuszczalniku chloroformu i metanolu (2:1, v:v), a następnie mieszaninę przeniesiono do obrotowej wyparki próżniowej w celu usunięcia rozpuszczalnika w 55°C. Trzykrotnie prowadzono powtarzane rozpuszczanie i odparowywanie. Następnie wysuszone związki fosfolipidowe uwodniono w 5 ml PBS (pH 7,4) w temperaturze pokojowej. Zawiesinę liposomalną przeniesiono następnie do małej fiolki na próbkę, a powietrze nad roztworem odessano i zastąpiono gazem perfluoropropanem (C3F8, Research Institute of Physical and Chemical Engineering of Nuclear Industry, Tianjin, Chiny). Następnie domieszkę mechanicznie wibrowano przez 45 sekund w amalgamatorze stomatologicznym (YJT Medical Apparatuses and Instruments, Szanghaj, Chiny) i ponownie zawieszono w 5 ml sterylnego PBS. Supernatant zebrano w celu uzyskania nieukierunkowanych NB. Następnie NB przemyto PBS i odwirowano przy 800 obr./min przez 3 minuty w celu usunięcia niezwiązanych lipidów. Ostatecznie stężenie NB oszacowano na około 2 x 108/ml za pomocą hemocytometru (Bürker-Türk, Wertheim, Niemcy). Rozmiar i dyspersję NB wykryto za pomocą mikroskopu (DM3000, Leica, Wetzlar, Niemcy), a morfologię NB zbadano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) (JEM-1011, JEOL, Inc., Peabody, MA, USA).
Aby przygotować znakowane fluorescencyjnie NB, dodawano 50 µg awidyny znakowanej FITC (SA, Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Chiny) na każdy 1×108/ml NB i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej.39 Awidinylowane NB trzykrotnie przemyto 3 ml PBS, a następnie odwirowano przy 800 obrotach na minutę przez 3 minuty. Znakowane FITC awidinylowane NB obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Synteza funkcjonalizowanego PEG tlenku grafenu (rGO-PEG):
Tlenek grafenu (GO) został zsyntetyzowany przy użyciu zmodyfikowanej metody Hummersa.20,40–42 GO nano-rozmiar (nano-GO) otrzymano po sonikacji zanurzeniowej przez 2 godziny. Aby sfunkcjonalizować nano-GO, 1,2 g wodorotlenku sodu (NaOH) dodano do zawiesiny nano-GO (1 mg/ml, 10 ml) i poddano działaniu ultradźwięków przez 3 godziny, a następnie dostosowano jego wartość pH do wartości przy użyciu kwasu chlorowodorowego (1 mln). Mieszaninę zobojętniono i oczyszczono przez wielokrotne płukanie i wirowanie. Następnie sześcioramienny rozgałęziony PEG zakończony grupą aminową (2 mg/ml) dodano do wyżej wymienionego roztworu GO (1 mg/ml) i poddano działaniu ultradźwięków przez 5 minut. Następnie do mieszaniny dodano chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo-N′-etylokarbodiimidu) (EDC; Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) w dwóch równych porcjach, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml w łącznie, a następnie sonikacja przez kolejną godzinę. Następnie roztwór wirowano przy 10 000 obr./min przez 10 minut w PBS trzy razy, aby usunąć wszelkie agregaty lub wielowarstwowe arkusze GO. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, otrzymując roztwór GO-PEG.
Monohydrat hydrazyny dodano do roztworu nano-GO i ogrzewano w 80°C przez 20 minut w celu uzyskania zagregowanych arkuszy nano-rGO. Te arkusze nano-rGO ponownie zawieszono przez sonikację w kąpieli przez 1 godzinę, a następnie doprowadzono do pH 8,2 przez dodanie NaOH. Odwirowanie i dializa były konieczne do usunięcia wszelkich zagregowanych arkuszy i tlenowych grup funkcyjnych. Supernatant zebrano po odwirowaniu i przemyto trzykrotnie filtrem wirówkowym Millipore (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) przy 4000 obr./min. Na koniec przygotowano roztwór nano-rGO-PEG i przechowywano go w temperaturze 4°C do dalszego użycia. Wiązania kowalencyjne w arkuszach nano-GO-PEG i nano-rGO-PEG potwierdzono różnymi technikami instrumentalnymi, takimi jak transformacja Fouriera w podczerwieni (FTIR, Nicolet 380, Thermo Electron Corporation, USA) i dyfrakcja rentgenowska (XRD) (Empyrean ; Malvern Panalytical BV, Almelo, Holandia).
Synteza biotynylowanego rGO-GPC3:
Biotynylowane przeciwciało GPC3 skoniugowane z cy7 (Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.) rozpuszczono w PBS jako roztwór podstawowy (1 mg/ml). Roztwór 20 µl biotynylowanego anty-GPC3 sprzężonego z cy7 dodano do rGO-PEG (20 mg/l, 1 ml) i mieszaninę poddano działaniu ultradźwięków przez 5 minut. Następnie do mieszaniny dodano EDC do końcowego stężenia 1 mg/ml. Mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Nadmiar biotynylowanego anty-GPC3 sprzężonego z cy7 usunięto przez filtrację wirówkową przez filtry odśrodkowe Amicon (EMD Millipore) z MWCO 100 kDa i przemyto 4-5 razy wodą destylowaną. Widma UV-vis nano-GO, nano-rGO, rGO-GPC3-cy7 i wolnego cy7 wykonano przy użyciu spektrometru UV-vis (Lambda 35, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Synteza NB-GPC3-rGO:
Następnie, 20 µl biotynylowanego rGO-GPC3 na 108 NB dodano do awidynylowanych NB i inkubowano w 4°C przez 1 godzinę. Mieszaninę następnie przemyto PBS w celu usunięcia niezwiązanego rGO-GPC3 i uzyskania NBs-GPC3-rGO. Rozkład wielkości i potencjał zeta NB, awidynowanych NB, roztworu NBs-GPC3-rGO określono przez pomiary dynamicznego rozpraszania światła przy użyciu analizatora Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Wielka Brytania).
Wykrywanie biotynylowanego rGO-GPC3 znakowanego FITC sprzężonego z awidinylowanymi NBS:
Ponieważ emisja Cy7 jest bliska podczerwieni, użyliśmy innego barwnika, FITC, aby udowodnić powiązanie NBs-GPC3-rGO za pomocą obrazu luminescencyjnego. W celu połączenia, wyznakowane FITC biotynylowane przeciwciało anty-GPC3 (Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.) dodano do roztworu GPC3-rGO i inkubowano w ciemnym obszarze. Intensywność fluorescencji biotynylowanego rGO-GPC3 znakowanego FITC związanego z awidinylowanymi NB oceniano za pomocą cytometru przepływowego (Becton Dickinson Co., Ltd., Franklin Lakes, NJ, USA).
Hodowla komórek:
Komórki HepG2 z ludzkiej linii komórkowej HCC, zakupiono od Shanghai Yu Bo Biotech Co. Ltd i hodowano w minimalnej pożywce Eagle (MEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) uzupełnionej 10% FBS (Gibco, Carlsbad, CA, USA ) i 1% penicylina/streptomycyna. Hodowle komórkowe utrzymywano w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w 37°C z pożywką zmienianą co drugi dzień. Całkowitą liczbę komórek określono za pomocą hemocytometru (Bürker-Türk). We wszystkich eksperymentach stosowano komórki rosnące wykładniczo.
Celowane wiązanie NBs-GPC3-rGO z komórkami HepG2 in vitro:
Zdolność wiązania NBs-GPC3-rGO testowano na komórkach HCC z receptorem GPC3. Komórki HepG2 (5 x 104/ml) inkubowano w płytkach z sześcioma studzienkami Costar jako monowarstwy w 90% MEM zawierającym 10% FBS z 1% penicyliną/streptomycyną w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie NBs-GPC3-rGO (1 x 108/ml) dodano do pożywki komórkowej na płytkach sześciostudzienkowych i inkubowano z komórkami HepG2. Po 1 godzinie ekspozycji statycznej pożywkę usunięto, a komórki przemyto trzykrotnie PBS w celu usunięcia niezwiązanych NB-GPC3-rGO. Po utrwaleniu, odwodnieniu, wysuszeniu i innych etapach, NBs-GPC3-rGO związane z komórkami HepG2 zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) (S-4100L, Hitachi, Tokio, Japonia).
Zniszczalność ultradźwiękowa różnych nanocząstek in vitro
W skrócie, NB poddano działaniu ultradźwięków o częstotliwości 1 MHz i mocy wyjściowej 3,5 W/cm2 przy użyciu sondy 20 mm (Instytut Obrazowania Ultradźwiękowego, Drugi Afiliowany Szpital Uniwersytetu Medycznego w Chongqing, Chongqing, Chiny). Istniały trzy grupy NB: ślepe (bez sonikacji), awidinylowane NB i NB-GPC3-rGO. Każdy cykl USG obejmował cztery klatki po 30 sekund przy cyklu pracy 50%. Po ekspozycji na ultradźwięki, stężenia różnych NB oceniano na hemocytometrze (Bürker-Türk). Każdy rodzaj próbki poddano trzykrotnej obróbce i pomiarom.
Ocena toksyczności komórkowej
Toksyczność PEGylowanego nano-rGO została określona w teście Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Komórki HepG2 rosnące w fazie logarytmicznej wysiano w gęstości 8 x 103 komórek/studzienkę (100 µl objętości na studzienkę) w 96-studzienkowych płytkach testowych przez 24 godziny, a następnie potraktowano różnymi stężeniami PEGylowanego nano-rGO przez 48 godzin. Po trzykrotnym przemyciu hodowli roztworem PBS, do każdej studzienki dodawano 10 µl roztworu CCK-8 na 2 godziny. Toksyczność komórkową mierzono czytnikiem mikropłytek (BioTek, Winooski, VT, USA) przy absorbancji 450 nm.
Wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) Pod wpływem promieniowania NIR (808 nm) pozakomórkowe ROS mogą być generowane z dwóch składników, którymi są czysta woda i roztwór NBs-GPC3-rGO (20 mg/L). Zewnątrzkomórkowe ROS z próbki wykryto przy użyciu 1,3-difenyloizobenzofuranu (DPBF) jako sondy. W skrócie, 30 µl roztworu N,N-dimetyloformamidu zawierającego DPBF (1 mg/ml) dodano do grupy kontrolnej składającej się z 3 ml powyższych dwóch roztworów. Następnie te dwa roztwory naświetlano laserem NIR przez różne czasy trwania. Po odwirowaniu mierzono absorbancję optyczną każdego roztworu przy 410 nm na spektrofotometrze (U-4100, Hitachi).
PTT in vitro po UTND
Komórki HepG2 wysiano na 96-studzienkowych płytkach z gęstością 8 x 103 komórek/studzienkę w pełnej pożywce MEM. Po 1 godzinie inkubacji w 37°C z NBs-GPC3-rGO lub kontrolą, fiolki zawierające osady komórkowe przechowywano w lodzie do napromieniowania. Komórki inkubowano z NBs-GPC3-rGO (20 mg/L) lub kontrolą w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Po 1 godzinie inkubacji studzienki trzykrotnie przemyto PBS. Studzienki z komórkami podzielono na siedem grup:
1) komórki HepG2 tylko z MEM (kontrola negatywna);
2) tylko UTND;
3) tylko laser;
4) tylko NBs-GPC3-rGO;
5) NBs-GPC3-rGO + UTND;
6) NBs-GPC3-rGO + laser;
7) NBs-GPC3-rGO + UTND + laser.
Parametry UTND były następujące:
- częstotliwość (1 MHz);
- intensywność wyjściowa (1,0 W/cm2);
- i napromienianie (1 minuta/studzienkę).
Parametry lasera były następujące:
- długość fali (808 nm);
- intensywność wyjściowa (2,0 W/cm2) i napromieniowanie (10 minut/studzienkę).
Po zakończeniu procesu do każdego dołka dodano 100 µl świeżej pożywki. Płytki trzymano w inkubatorze przez 24, 48 i 72 godziny. Żywotność komórek oszacowano w teście CCK-8, jak opisano.
Analiza statystyczna:
Do analizy statystycznej zastosowano pakiet oprogramowania SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Poziom istotności we wszystkich analizach statystycznych ustalono na prawdopodobieństwo P<0,05. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Poszczególne grupy analizowano za pomocą analizy wariancji i testów t-Studenta.
Wyniki i dyskusja:
Nieinwazyjne ultradźwiękowe
obrazowanie molekularne w połączeniu z zaletami ultradźwięków ze wzmocnieniem
kontrastowym może scharakteryzować procesy nowotworowe na poziomie
molekularnym. Jego
akceptacja wynika po części z niektórych nieodłącznych zalet ultradźwięków, a
mianowicie braku promieniowania jonizującego, nieinwazyjności oraz wysokiej
wrażliwości przestrzennej i czasowej. Ma wiele potencjalnych
zastosowań we wczesnym wykrywaniu raka, monitorowaniu odpowiedzi na leczenie
scharakteryzowania guza i kierowaniu terapiami nowotworowymi. Środki
kontrastowe do ultradźwiękowego obrazowania molekularnego mają również
potencjalne zastosowania w dziedzinie hipertermii do dostarczania leków
chemioterapeutycznych i terapii genowej. NB jako jeden z
obiecujących środków kontrastowych były szeroko stosowane w dostarczaniu leków,
a także były wykorzystywane do zwiększania koncentracji lokalizacji ładunków
nośników po ultradźwiękach. Tutaj awidinylowane NB zsyntetyzowano w
zmodyfikowanym procesie emulgowania (rusynek 1).37,38 Do syntezy wybrano
DSPE-PEG2000 i DSPE-PEG2000-biotynę jako samoorganizujące się otoczki NB do
kapsułkowania gazu C3F8. Odegrały również kluczową rolę w stabilnym rozkładzie
obciążeń, co zostanie szczegółowo wyjaśnione w dalszej części artykułu. Te
liposomowe NB w zawiesinie mają mlecznobiały kolor o średnicy 292,2±13,3 nm (rysunek
2A i rysunek S1A i D) o stężeniu ~2 x 108/ml. Obraz TEM (wstawka na ryc. 2A)
pokazuje sferyczną morfologię NB i potwierdza zakres rozkładu wielkości. Aby
udowodnić awidylację NB, zsyntetyzowano i scharakteryzowano za pomocą
mikroskopii fluorescencyjnej awidinylowane NB znakowane FITC zielonym
barwnikiem. Rycina 2C
pokazuje zieloną emisję fluorescencji z różnych części, która koreluje z
lokalizacjami NB (Rycina 2B), wskazując na udaną awidylację NB. W międzyczasie
rozkład wielkości tych awidinylowanych NB wzrósł do 467,6±11,5 nm (rysunek S1B
i E).
|
Rysunek 1 |
 |
Schemat ideowy syntezy NBs-GPC3-rGO skonstruowanego do celowanego dostarczania rGO i terapii fototermicznej. Skróty: - DSPC, 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina, DSPE-PEG2000, 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000]; - DSPE-PEG2000-biotyna, 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl (glikol polietylenowy)-2000)]; - GPC3, siarczan heparyny, proteoglikan, glipikan-3; - UTND, niszczenie nanopęcherzyków nakierowanych na ultradźwięki. |
|
Rysunek 2 |
 |
Charakterystyka nanopęcherzyków, dowód, że łańcuchy są zbieżne. Uwagi: Pręt w A–C wynosi 10 µm, wstawka na Rysunku 2A, słupek=100 nm, słupek w G i H=4 µm, słupek w I=0,6 µm. (A) Nanopęcherzyki (NB) w zawiesinie miały mlecznobiały kolor. Czysty roztwór NB obserwowano pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 1000x). (B) Awidinylowane nanopęcherzyki zaobserwowano pod mikroskopem świetlnym (powiększenie, 1000x). (C) Nanopęcherzyki skoniugowane ze znakowaną FITC awidyną pod mikroskopem fluorescencyjnym (powiększenie 1000x). Powierzchnia nanopęcherzyków wydawała się zielona pod mikroskopem fluorescencyjnym, co wskazuje, że awidyna znakowana FITC była upakowana na powierzchni NB. (D) Widma w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) tlenku grafenu-glikolu polietylenowego (GO-PEG) i zredukowanego tlenku grafenu (rGO)-PEG. Próbki GO-PEG i rGO-PEG przefiltrowano trzykrotnie przez filtr o wartości odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 100 kDa w celu całkowitego usunięcia nieskoniugowanego PEG (10 kDa). (E) Widmo AUV w bliskiej podczerwieni (NIR) roztworu nano-rGO-PEG-GPC3-cy7 i wolnego barwnika cy7. (F) Wydajność wiązania biotynylowanego FITC-znakowanego FITC rGO-PEG-GPC3 z awidynylowanymi NB określono metodą cytometrii przepływowej. Porównanie intensywności fluorescencji dla NB (linia czarna, kontrola) i wyznakowanych FITC NB-GPC3-rGO (linia czerwona) wskazuje na udane wiązanie rGO-PEG-GPC3 z awidinylowanymi NB. (G) Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała prawidłową morfologię powierzchni komórek Hep G2 (4000×). W skaningowej mikroskopii elektronowej ukierunkowane NBs-GPC3-rGO zgrupowano na powierzchni komórek Hep G2 (odpowiednio H i I, 4000× i 10000×). Skrót: GPC3, siarczan heparyny proteoglikanu glipikan-3. |
GO został przygotowany
zmodyfikowaną metodą Humersa42 o początkowej wielkości bocznej ~5 µm i
pojedynczej warstwie. Aby nadawał się do wstrzykiwania, arkusze nano-GO
uzyskano za pomocą ultradźwięków tubowych. Rysunek 3A przedstawia typowy obraz
AFM arkuszy nano-GO o rozmiarze 50±13 nm. Następnie sześcioramienny
rozgałęziony PEG zakończony grupami aminowymi został kowalencyjnie związany z
grupą kwasu karboksylowego w reakcji amidowej, co sprawia, że nano-GO-PEG
jest rozpuszczalny i stabilnie dyspergujący w roztworze buforowym. Ponadto do
roztworu nano-GO-PEG dodano monohydrat hydrazyny i ogrzewano w 80°C przez 20 minut. Podczas
ogrzewania kolor tego roztworu zmieniał się stopniowo z żółtego na czarny, co
wskazuje na redukcję GO i tworzenie nano-rGO-PEG. Widma UV-Vis zarówno
nano-GO-PEG, jak i nano-rGO-PEG przedstawiono na Figurze 3B; przesunięcie piku
absorpcji (od ~230 do 275 nm) oraz zwiększona absorpcja w obszarze widzialnym i
NIR (wstawka na rysunku 3B) również potwierdzają powrót sprzężonej struktury π
grafenu.44,45 Spektroskopia Ramana nano-GO i nano-rGO przeprowadzono w
temperaturze pokojowej przy użyciu Raman Microprobe (LabRAM HR800; Horiba
Scientific, Jobin-Yvon, Francja) (rysunek S2). W przypadku próbki nano-rGO-PEG
na obrazie XRD wystąpił jeden pik przy ~21,69°, co wskazuje, że większość grup
funkcyjnych tlenu została usunięta, prowadząc w ten sposób do skutecznej
redukcji GO (rysunek S3).46,47 Wraz ze wzrostem absorpcji NIR , około 9,2 razy
przy 808 nm (ryc. 3B), ogrzewanie fototermiczne stało się bardziej efektywne,
co jest jednym z kluczowych elementów fototerapii. Nowy szeroki pik, który
pojawił się przy ~2860 cm−1 zarówno w próbkach nano-GO-PEG, jak i nano-rGO-PEG
w widmach FTIR (Rysunek 2D) można przypisać symetrycznemu trybowi rozciągania
grup metylenowych PEG, wskazując, że cząsteczki PEG zostały pomyślnie
skoniugowane z arkuszami GO, a taka koniugacja jest dość stabilna nawet po
redukcji chemicznej. Ponadto silny pik przy ~1100 cm-1 w próbce nano-GO-PEG
można przypisać drganiom grup –C–O– PEG. Silne piki przy ~3400 cm-1 i 1650 cm-1
były prawdopodobnie spowodowane znacznie większą liczbą grup -OH w nano-GO-PEG
w porównaniu z próbką nano-rGO-PEG.
|
Rysunek 3 |
 |
Charakterystyka arkuszy zredukowanego tlenku grafenu (rGO). (A) Obraz AFM zredukowanego tlenku nanografenu (nano-rGO). Obraz jest w skali wysokości 10 nm. (B) Widmo UV-vis-bliskiej podczerwieni (NIR) roztworu nano-GO-glikolu polietylenowego (PEG) i nano-rGO-PEG. (C) Fototermiczne krzywe ogrzewania roztworów nano-rGO-PEG i nano-GO-PEG oraz wody dejonizowanej (DIW) poddane działaniu lasera 808 nm przy gęstości mocy 2 W/cm2. Czarna krzywa to 1 mL roztworów o stężeniu 20 mg/L nano-rGO-PEG, czerwona krzywa to nano-GO-PEG, a ciemnoniebieska krzywa to DIW. |
Po koniugacji z PEG, roztwór nano-rGO-PEG zaszczepiono roztworem biotyny GPC3 znakowanym cy7. Widma UV-Vis czystego barwnika cy7 wykazały silny pik absorpcji przy 749 nm z małym ramieniem (rysunek 2E), który był również widoczny po szczepieniu nano-rGO-PEG, potwierdzając sprzęganie GPC3-Cy7 z PEG. Ponadto, intensywności fluorescencji awidynylowanych NB po inkubacji z biotynylowanym rGO-GPC3 wyznakowanym FITC wskazywały, że około 86,5% awidynylowanych NB było z powodzeniem skoniugowanych z biotynylowanym rGO-GPC3 (rysunek 2F). Wreszcie rozkład wielkości wzrósł do 700,4±52,9 nm (rysunek S1C i F). Stopniowo zwiększający się rozmiar NB jest również dowodem na udane łączenie różnych części. Ponadto potencjał zeta NB-GPC3-rGO (-18,74±2,02 mV) był niższy niż NB (-24,39±2,40 mV), co wskazuje na nieznaczny spadek jego stabilności i dyspersji, jak pokazano na rysunku S4.
Aby ocenić wydajność ogrzewania fototermicznego, wykreślono wzrost temperatury jako funkcję czasu napromieniania wody dejonizowanej (woda DI), nano-GO (20 mg/L) i nano-rGO (20 mg/L) przy gęstości mocy 2 W/cm2 NIR (808 nm) pokazanej na Figurze 3C. Temperatura wody DI powoli wzrastała od 23°C do 30°C w ciągu 10 minut, podczas gdy temperatura roztworu nano-GO wykazywała podobne zachowanie z maksymalną wartością 39°C w ciągu 10 minut. Można to wytłumaczyć bardzo słabą absorpcją wody DI i roztworu nano-GO przy długości fali 808 nm (rysunek 3B). Natomiast temperatura roztworu nano-rGO gwałtownie wzrosła do 60°C w tych samych warunkach. Co ważne, szybko osiągnął 50°C (próg fotoablacji) w ciągu 3,4 minuty w porównaniu z 5 minutami w pracy Dai,6 wskazując na bardziej wydajne ogrzewanie fototermiczne naszego rozwiązania nano-rGO. Ponadto roztwór nano-rGO wykazał monotoniczną poprawę wydajności ogrzewania fototermicznego wraz ze wzrostem stężenia. Czas potrzebny do osiągnięcia temperatury 50°C wynosił około 4,7, 3,4 i 2,6 minuty dla stężeń odpowiednio 10, 20 i 40 mg/L. Im więcej arkuszy zawiera nano-rGO, tym większa absorpcja NIR, która jest przekształcana w ciepło.
Co więcej, awidynowane NB zostały połączone z nano-rGO-PEG-GPC3-biotyną przez układ awidyna-biotyna i utworzyły oczekiwane cząstki dostarczające z kontrastem. (Rysunek 1). Następnie inkubowano go z komórkami HepG2 w sześciostudzienkowych płytkach Costar. Obraz SEM pokazuje, że duża ilość NBs-GPC3-rGO została z powodzeniem skierowana na powierzchnię komórek HepG2 (rys. 1, 2H i I dolny panel), podczas gdy oryginalna komórka miała bardzo czystą powierzchnię (rys. 2G).
Zniszczenie NB ukierunkowane na ultradźwięki oceniano dla awidynowanych NB, NB-GPC3-rGO i ślepej próby (roztwór NB bez sonikacji). Rysunek 4A przedstawia stężenie NB w funkcji czasu sonikacji, z którego wartości okresu półtrwania atenuacji (t/2) wynosiły odpowiednio 85 sekund i 54 sekundy dla awidinylowanych NB i NB-GPC3-rGO, z istotną różnicą pomiędzy dwoma typami NB i grupą Blank (P<0,05). Jednakże, istniała statystycznie istotna różnica między awidynylowanymi NB a NB-GPC3-rGO (P<0,05). Największą skuteczność niszczenia NB w przypadku NB-GPC3-rGO można przypisać efektowi rozbioru rGO na UTND.
|
Rysunek 4 |
  |
|
|
|
Ilościowy test hamowania wzrostu w komórkach HepG2 po różnych terapiach. Uwagi: (A) Niszczenie nanopęcherzyków (NB) zredukowanego tlenku grafenu (rGO) za pomocą ultradźwięków w porównaniu z grupą Blank i awidinylowanymi NB. (B) Dane dotyczące żywotności komórek na podstawie Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dla komórek Hep G2 inkubowanych przez 48 godzin z PEGylowanym nano-rGO. (C) Widma absorpcyjne sondy 1,3-difenyloizobenzofuranu (DPBF) przy różnych czasach naświetlania. (D) Efekt żywotności komórkowej komórek Hep G2 przy różnych zabiegach. Wskaźnik żywotności komórek określono w teście CCK-8 po 24, 48 i 72 godzinach po różnym traktowaniu. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n=7). Żywotność komórek NBs-GPC3-rGO + laser (grupa 6) i NBs-GPC3-rGO + niszczenie NBs-GPC3-rGO + celowane ultradźwiękami (UTND) + laser (grupa 7) są znacznie niższe niż w innych grupach (P <0,05). Skróty: DPBF, 1,3-difenyloizobenzofuran; GPC3, siarczan heparyny proteoglikanu glipikan-3 |
Ponadto zbadaliśmy biokompatybilność kowalencyjnie PEGylowanego nano-rGO z liniami komórkowymi HepG2. Stwierdzono, że połowa maksymalnego stężenia hamującego nano-rGO-PEG wynosi 61 mg/l dla ludzkiej linii komórkowej HCC HepG2 (rysunek 4B). Jest mniejszy niż wcześniej zgłoszono, jednak PEGylowany nano-rGO zmniejszył żywotność komórek MCF-7 (linia komórek ludzkiego raka piersi) przy ~80 mg/L. Wynika z tego, że nano-rGO-PEG ma zadowalający wynik oceny toksyczności. Tak więc stężenie nano-rGO powinno być znacznie niższe niż 61 mg/L, aby zapewnić, że zdolność zabijania komórek pochodzi z PTT, a nie z samej toksyczności. Należy również wziąć pod uwagę zależną od stężenia wydajność fototermiczną (rysunek S5). W rezultacie, z wyjątkiem specjalnych instrukcji, przyjęto umiarkowane stężenie 20 mg/L, zapewniając jednocześnie lepszą wydajność fototermiczną (rysunek S5) i niższą cytotoksyczność (rysunek 4B) nano-rGO w naszych eksperymentach.
Co więcej, terapia fotodynamiczna (PDT) jest rodzajem podejścia terapeutycznego, które wymaga fotouczulacza do wytwarzania ROS w celu wyeliminowania tkanek nowotworowych.48,49 W tym celu wykryto zewnątrzkomórkowe generowanie ROS w próbce przy użyciu DPBF jako sondy. Można było zaobserwować odpowiednio spadek absorpcji charakterystycznej DPBF. Jak pokazano na Figurze 4C, absorbancja roztworu DPBF z NBs-GPC3-rGO zmniejszyła się znacząco w miarę upływu czasu naświetlania, co sugeruje, że wystarczający poziom ROS był indukowany przez NBs-GPC3-rGO. Natomiast czysta woda doprowadziła do bardzo ograniczonego wytwarzania ROS przy tym samym naświetlaniu laserem. Dlatego NBs-GPC3-rGO zastosowano jako fotouczulacz do wykonywania PDT, który może być stosowany jako leczenie uzupełniające PTT.
Na koniec, efekt termoterapii naszych próbek oceniono na podstawie wskaźnika żywotności komórek przy użyciu testu CCK-8. Rysunek 4D przedstawia wskaźniki żywotności komórek w różnych grupach terapeutycznych po 24, 48 i 72 godzinach. Prawie wszystkie komórki HepG2 inkubowane z NBs-GPC3-rGO zostały zniszczone w wyniku naświetlania światłem NIR o mocy 2 W/cm2 przez 10 minut z (grupa 7) lub bez (grupa 6) UTND, podczas gdy wszystkie inne grupy wykazywały prawie 100% żywotność. W porównaniu z innymi grupami leczenia, wskaźniki żywotności komórek w grupach 6 i 7 wykazały znacznie niższą wydajność (P<0,05), co sugeruje, że NBs-GPC3-rGO z naświetlaniem laserem był głównym czynnikiem zabijania komórek. Chociaż nie było statystycznej różnicy między grupami 6 i 7 (P>0,05), UTND miało pozytywny wpływ na naświetlanie laserem w zmniejszaniu żywotności komórek.
W UTND stwierdzono, że NB zostały zniszczone w krótkim czasie (rysunek 4A). Nanoarkusze rGO były znane jako nanonóż lub nanoostrze i były używane do cięcia bakterii i błony komórkowej z ich ostrymi krawędziami.50 Analogicznie, nanoarkusz rGO działałby również jako ostrze do cięcia NB, zwłaszcza podczas ultradźwięków. W rezultacie wydajność UTND jest znacznie poprawiona o 50% w tym samym czasie sonikacji (rysunek 4A) po połączeniu nanoarkuszów rGO. Co więcej, dużą liczbę arkuszy rGO pokryto NB poprzez układ awidyna-biotyna i utrzymywano ze sobą w bliskim kontakcie. Gdy NB-GPC3-rGO są niszczone przy użyciu UTND, rGO-GPC3 może zostać uwolniony w celu zwiększenia stężenia rGO wokół komórek HepG2. rGO-GPC3 może być przyłączony do powierzchni komórek HepG2 dzięki celowaniu przeciwciał GPC3. Roztwory nano-rGO wykazywały zależny od stężenia efekt fototermicznego ogrzewania6, co jest zgodne z naszymi wynikami (rysunki 3C i S5). Ponadto UTND ułatwia przenoszenie cząsteczek pozakomórkowych do komórek poprzez sonoporację. Dlatego, jeśli chodzi o test żywotności komórek, zauważyliśmy, że efekt PTT NBs-GPC3-rGO jest najlepszy w porównaniu z innymi grupami, a wskaźnik żywotności komórek 72-godzinnych wynosi 2,26% (rysunek 4D).
Wnioski:
Podsumowując, opracowaliśmy nowy ultrasonograficzny środek kontrastowy zawierający enkapsulowane NB nano-rGO, który może zapewnić wizualizację i ulepszone PTT. GPC3 działa jako docelowa cząsteczka sondy do określonych miejsc na powierzchni komórek HepG2. NBs-GPC3-rGO został zniszczony pod wpływem ultradźwięków, co zwiększyło miejscowe stężenie rGO, zwiększając tym samym ablację fototermiczną komórek rakowych pod wpływem napromieniowania NIR. W rezultacie, w ciągu 72 godzin, wskaźnik żywotności komórek nowotworowych leczonych PTT wyniósł około 2,26% pod wpływem lasera UTND i NIR. Nasze wyniki stanowią podstawę do dalszych badań i klinicznego zastosowania obrazowania ultrasonograficznego ukierunkowanego na GPC3 w nieinwazyjnym nadzorze podczas procesu PTT przy użyciu rGO.
|
Rysunek S 1 |
 |
Średnia wielkość cząstek NB (A i D), awidinylowanych NB (B i E) i NB-GPC3-rGO (C i F) określona przez analizę dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Trzy krzywe (D–F) średniej wielkości cząstek przeanalizowano testem Shapiro-Wolfa, aby wyjaśnić, że wszystkie trzy grupy danych miały rozkład Gaussa. Skróty: GPC3, siarczan heparyny proteoglikan glipikan-3; NB, nanopęcherzyki; rGO, zredukowany tlenek grafenu. |
|
Rysunek S 2 |
 |
|
Spektroskopię Ramana przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy użyciu Raman Microprobe (LabRAM HR800; Horiba Scientific, Jobin-Yvon, Francja). Uwaga: Stosunek ID/IG nano-rGO znacznie wzrósł, co wskazuje, że proces redukcji zmienił strukturę G-O z dużą ilością defektów strukturalnych. Skróty: GO, tlenek grafenu; rGO, zredukowany tlenek grafenu. |
|
Rysunek S 3 |
 |
Wzory XRD nano-GO-PEG i nano-rGO-PEG. Skróty: GO, tlenek grafenu; r-GO, zredukowany tlenek grafenu; XRD, dyfrakcja rentgenowska. |
|
Rysunek S 4 |
  |
|
Potencjał zeta roztworów NB (A) i NBs-GPC3-rGO (B) określono za pomocą pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Skróty: GPC3, siarczan heparyny proteoglikan glipikan-3; NB, nanopęcherzyki; rGO, zredukowany grafen grafitowy. |
|
Rysunek S 5 |
 |
|
Fototermiczne krzywe nagrzewania roztworów nano-rGO. Uwaga: Wzrost wykresów temperatury dla różnych stężeń nano-rGO i wody dejonizowanej (DIW), nano-GO (20 mg/mL) i nano-rGO (20 mg/mL) przy 808 nm przy 2 W/cm2 NIR.
Skróty: rGO, grafit zredukowany; NIR, bliska podczerwień. |
Podziękowania:
Niniejsza praca była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (grant nr 81571682 i 61771156), HAI YAN Science Foundation of Harbin Medical University Cancer Hospital (grant nr JJQN2018-18), Open Fund of Key Laboratory of Microsystems and Microstructure Manufacturing Ministry of Edukacja (HIT) (dotacja nr 2016KM010).
Oświadczenie:
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów w tej pracy.
Przypisy:
1. Global Burden of Disease Cancer Collaboration; Fitzmaurice C, Allen C, Barber RM, et al. Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived With Disability, and Disability-Adjusted Life-years for 32 Cancer Groups, 1990 to 2015: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study. JAMA Oncol. 2017;3(4):524–548. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
2. Song P, Tobe RG, Inagaki Y, et al. The management of hepatocellular carcinoma around the world: a comparison of guidelines from 2001 to 2011. Liver Int. 2012;32(7):1053–1063. [PubMed] [Google Scholar]
3. Yu J, Xu QG, Wang ZG, et al. Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2018;68(6):1214–1227. [PubMed] [Google Scholar]
4. Chen Z, Wang Q, Wang H, et al. Ultrathin PEGylated W18O49 nano-wires as a new 980 nm-laser-driven photothermal agent for efficient ablation of cancer cells in vivo. Adv Mater. 2013;25(14):2095–2100. [PubMed] [Google Scholar]
5. Yang K, Yang G, Chen L, et al. FeS nanoplates as a multifunctional nano-theranostic for magnetic resonance imaging guided photothermal therapy. Biomaterials. 2015;38:1–9. [PubMed] [Google Scholar]
6. Robinson JT, Tabakman SM, Liang Y, et al. Ultrasmall reduced graphene oxide with high near-infrared absorbance for photothermal therapy. J Am Chem Soc. 2011;133(17):6825–6831. [PubMed] [Google Scholar]
7. Liu Y, Ashton JR, Moding EJ, et al. A Plasmonic Gold Nanostar Theranostic Probe for In Vivo Tumor Imaging and Photothermal Therapy. Theranostics. 2015;5(9):946–960. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
8. Zha Z, Yue X, Ren Q, Dai Z. Uniform polypyrrole nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for photothermal ablation of cancer cells. Adv Mater. 2013;25(5):777–782. [PubMed] [Google Scholar]
9. Markovic ZM, Harhaji-Trajkovic LM, Todorovic-Markovic BM, et al. In vitro comparison of the photothermal anticancer activity of graphene nanoparticles and carbon nanotubes. Biomaterials. 2011;32(4):1121–1129. [PubMed] [Google Scholar]
10. Bitounis D, Ali-Boucetta H, Hong BH, Min DH, Kostarelos K. Prospects and challenges of graphene in biomedical applications. Adv Mater. 2013;25(16):2258–2268. [PubMed] [Google Scholar]
11. Feng L, Liu Z. Graphene in biomedicine: opportunities and challenges. Nanomedicine. 2011;6(2):317–324. [PubMed] [Google Scholar]
12. Feng L, Zhang S, Liu Z. Graphene based gene transfection. Nanoscale. 2011;3(3):1252–1257. [PubMed] [Google Scholar]
13. Yang X, Wang Y, Huang X, et al. Multi-functionalized graphene oxide based anticancer drug-carrier with dual-targeting function and pH-sensitivity. J Mater Chem. 2011;21(10):3448–3454. [Google Scholar]
14. Ma X, Tao H, Yang K, et al. A functionalized graphene oxide-iron oxide nanocomposite for magnetically targeted drug delivery, photothermal therapy, and magnetic resonance imaging. Nano Res. 2012;5(3):199–212. [Google Scholar]
15. Yang K, Feng L, Shi X, Liu Z. Nano-graphene in biomedicine: theranostic applications. Chem Soc Rev. 2013;42(2):530–547. [PubMed] [Google Scholar]
16. Shen H, Zhang L, Liu M, Zhang Z. Biomedical applications of graphene. Theranostics. 2012;2(3):283–294. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
17. Shi X, Gong H, Li Y, Wang C, Cheng L, Liu Z. Graphene-based magnetic plasmonic nanocomposite for dual bioimaging and photothermal therapy. Biomaterials. 2013;34(20):4786–4793. [PubMed] [Google Scholar]
18. Sun X, Liu Z, Welsher K, et al. Nano-Graphene Oxide for Cellular Imaging and Drug Delivery. Nano Res. 2008;1(3):203–212. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
19. Zhang L, Xia J, Zhao Q, Liu L, Zhang Z. Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs. Small. 2010;6(4):537–544. [PubMed] [Google Scholar]
20. Liu Z, Robinson JT, Sun X, Dai H. PEGylated nanographene oxide for delivery of water-insoluble cancer drugs. J Am Chem Soc. 2008;130(33):10876–10877. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
21. Wang Y, Wang K, Zhao J, et al. Multifunctional mesoporous silica-coated graphene nanosheet used for chemophotothermal synergistic targeted therapy of glioma. J Am Chem Soc. 2013;135(12):4799–4804. [PubMed] [Google Scholar]
22. Kaneko OF, Willmann JK. Ultrasound for molecular imaging and therapy in cancer. Quant Imaging Med Surg. 2012;2(2):87. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
23. Mullick Chowdhury S, Wang TY, Bachawal S, et al. Ultrasound-guided therapeutic modulation of hepatocellular carcinoma using complementary microRNAs. J Control Release. 2016;238:272–280. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
24. Zheng SG, Xu HX, Liu LN. Management of hepatocellular carcinoma: The role of contrast-enhanced ultrasound. World J Radiol. 2014;6(1):7–14. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
25. Wu M, Zhao H, Guo L, et al. Ultrasound-mediated nanobubble destruction (UMND) facilitates the delivery of A10-3.2 aptamer targeted and siRNA-loaded cationic nanobubbles for therapy of prostate cancer. Drug Deliv. 2018;25(1):226–240. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
26. Song Z, Wang Z, Shen J, Xu S, Hu Z. Nerve growth factor delivery by ultrasound-mediated nanobubble destruction as a treatment for acute spinal cord injury in rats. Int J Nanomedicine. 2017;12:1717–1729. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
27. Yang X, Liu H, Sun CK, et al. Imaging of hepatocellular carcinoma patient-derived xenografts using 89Zr-labeled anti-glypican-3 monoclonal antibody. Biomaterials. 2014;35(25):6964–6971. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
28. Hsu HC, Cheng W, Lai PL. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Res. 1997;57(22):5179–5184. [PubMed] [Google Scholar]
29. Gao W, Kim H, Feng M, et al. Inactivation of Wnt signaling by a human antibody that recognizes the heparan sulfate chains of glypican-3 for liver cancer therapy. Hepatology. 2014;60(2):576–587. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
30. Filmus J. Glypicans in growth control and cancer. Glycobiology. 2001;11(3):19R–23R. [PubMed] [Google Scholar]
31. Shirakawa H, Kuronuma T, Nishimura Y, et al. Glypican-3 is a useful diagnostic marker for a component of hepatocellular carcinoma in human liver cancer. Int J Oncol. 2009;34(3):649–656. [PubMed] [Google Scholar]
32. Wang HL, Anatelli F, Zhai QJ, Adley B, Chuang ST, Yang XJ. Glypican-3 as a useful diagnostic marker that distinguishes hepatocellular carcinoma from benign hepatocellular mass lesions. Arch Pathol Lab Med. 2008;132(11):1723–1728. [PubMed] [Google Scholar]
33. di Tommaso L, Franchi G, Park YN, et al. Diagnostic value of HSP70, glypican 3, and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis. Hepatology. 2007;45(3):725–734. [PubMed] [Google Scholar]
34. Teulon JM, Delcuze Y, Odorico M, et al. Single and multiple bonds in (strept)avidin-biotin interactions. J Mol Recognit. 2011;24(3):490–502. [PubMed] [Google Scholar]
35. Weber PC, Ohlendorf DH, Wendoloski JJ, Salemme FR. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 1989;243(4887):85–88. [PubMed] [Google Scholar]
36. Holmberg A, Blomstergren A, Nord O, Lukacs M, Lundeberg J, Uhlén M. The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis. 2005;26(3):501–510. [PubMed] [Google Scholar]
37. Zhang Y, Chang R, Li M, Zhao K, Zheng H, Zhou X. Docetaxel-loaded lipid microbubbles combined with ultrasound-triggered microbubble destruction for targeted tumor therapy in MHCC-H cells. Onco Targets Ther. 2016;9(Issue 1):4763. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
38. Kang J, Wu X, Wang Z, et al. Antitumor effect of docetaxel-loaded lipid microbubbles combined with ultrasound-targeted microbubble activation on VX2 rabbit liver tumors. J Ultrasound Med. 2010;29(1):61–70. [PubMed] [Google Scholar]
39. Stieger SM, Dayton PA, Borden MA, et al. Imaging of angiogenesis using Cadence contrast pulse sequencing and targeted contrast agents. Contrast Media Mol Imaging. 2008;3(1):9–18. [PubMed] [Google Scholar]
40. Hummers WS, Offeman RE. Preparation of Graphitic Oxide. J Am Chem Soc. 1958;80(6):1339. [Google Scholar]
41. Yang K, Zhang S, Zhang G, Sun X, Lee ST, Liu Z. Graphene in mice: ultrahigh in vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy. Nano Lett. 2010;10(9):3318–3323. [PubMed] [Google Scholar]
42. Zhang J, Hu P, Zhang R, et al. Soft-lithographic processed soluble micropatterns of reduced graphene oxide for wafer-scale thin film transistors and gas sensors. J Mater Chem. 2012;22(2):714–718. [Google Scholar]
43. Tinkov S, Winter G, Coester C, Bekeredjian R. New doxorubicin-loaded phospholipid microbubbles for targeted tumor therapy: Part I – Formulation development and in-vitro characterization. J Control Release. 2010;143(1):143–150. [PubMed] [Google Scholar]
44. Kim J, Kim F, Huang J. Seeing graphene-based sheets. Mater Today. 2010;13(3):28–38. [Google Scholar]
45. Acik M, Lee G, Mattevi C, Chhowalla M, Cho K, Chabal YJ. Unusual infrared-absorption mechanism in thermally reduced graphene oxide. Nat Mater. 2010;9(10):840–845. [PubMed] [Google Scholar]
46. Zhang J, Li J, Wang Z, et al. Low-Temperature Growth of Large-Area Heteroatom-Doped Graphene Film. Chemistry of Materials. 2014;26(7):2460–2466. [Google Scholar]
47. Wojtoniszak M, Chen X, Kalenczuk RJ, et al. Synthesis, dispersion, and cytocompatibility of graphene oxide and reduced graphene oxide. Colloids Surf B Biointerfaces. 2012;89(1):79–85. [PubMed] [Google Scholar]
48. Kuo WS, Chang YT, Cho KC, et al. Gold nanomaterials conjugated with indocyanine green for dual-modality photodynamic and photothermal therapy. Biomaterials. 2012;33(11):3270–3278. [PubMed] [Google Scholar]
49. Zhong RcL, Rm CN, Multifunctional Anticancer LA. Platform for Multimodal Imaging and Visible Light Driven Photodynamic/Photo-thermal Therapy. Chem Mater. 2015;27:1751–1763. [Google Scholar]
50. Papi M, Palmieri V, Bugli F, et al. Biomimetic antimicrobial cloak by graphene-oxide agar hydrogel. Sci Rep. 2016;6(1):12. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Komentarze
Prześlij komentarz