Pośrednie dowody na nienaturalne pochodzenie wirusa SARS-CoV-2

fot. istock

 

Homologia MSH3 i potencjalny związek rekombinacyjny z miejscem rozszczepienia furyny w SARS-CoV-2

 

tłumaczenie: W rzeczy samej

źródło:

Autorzy:

1.      Balamurali K. Ambati - Knight's Campus for Accelerating Scientific Impact, University of Oregon, Eugene, OR, Stany Zjednoczone

2.      Akhil Varshney - Dr. Shroff's Charity Eye Hospital, New Delhi, Indie

3.      Kenneth Lundstrom - PanTherapeutics, Lutry, Szwajcaria

4.      Giorgio Palú  - Katedra Medycyny Molekularnej, Uniwersytet w Padwie, Padwa, Włochy

5.      Bruce D. Uhal - Katedra Fizjologii, Uniwersytet Stanowy Michigan, East Lansing, MI, Stany Zjednoczone

6.      Vladimir N. Uversky - Zakład Medycyny Molekularnej, Morsani College of Medicine, University of South Florida (USF) Health Byrd Alzheimer's Institute, University of South Florida, Tampa, FL, Stany Zjednoczone

7.      Adam M. Brufsky - Oddział Hematologii/Onkologii, Wydział Medycyny, Centrum Medyczne Uniwersytetu w Pittsburghu (UPMC) Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone

Wśród licznych różnic mutacji punktowych między SARS-CoV-2 a koronawirusem nietoperza RaTG13, tylko 12-nukleotydowe miejsce rozszczepienia furyn (FCS) przekracza 3 nukleotydy. Poszukiwanie metodą BLAST ujawniło, że 19. nukleotydowa część genomu SARS-CoV-2 obejmująca miejsce rozszczepienia furynu jest w 100% komplementarna do zoptymalizowanej kodonowo sekwencji, która jest odwrotnym dopełnieniem ludzkiego homologu mutS (MSH3). Sekwencja odwrotnego dopełnienia obecna w SARS-CoV-2 może występować przypadkowo, ale należy wziąć pod uwagę inne możliwości. Rekombinacja w żywicielu pośrednim jest mało prawdopodobnym wyjaśnieniem. Wirusy jednoniciowego RNA, takie jak SARS-CoV-2, wykorzystują w zakażonych komórkach szablony RNA o ujemnej nici, co może prowadzić, poprzez rekombinację wyboru kopii z RNA SARS-CoV-2 o ujemnym znaczeniu, do integracji ujemnej nici MSH3, w tym FCS, z genomem wirusowym. W każdym razie, obecność 19-nukleotydowej sekwencji RNA zawierającej FCS o 100% identyczności z odwrotnym dopełnieniem mRNA MSH3 jest wysoce niezwykłe i wymaga dalszych badań.

 

Wstęp

Na podstawie ostatniej publikacji opisującej warianty insercyjne wirusa SARS-CoV-2 (1) chcielibyśmy zwrócić uwagę na nasze ostatnie odkrycia dotyczące sekwencji miejsca rozszczepienia furyn (FCS) w białku Spike (S) wirusa SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 wywołujący pandemię COVID-19 (2) ma 82,3% identyczności aminokwasów z koronawirusem nietoperzy SL-CoVZC45, 77,2% identyczności aminokwasów z SARS-CoV i 96,2% identyczności sekwencji genomu z koronawirusem nietoperzy RaTG13. Podczas gdy między SARS-CoV-2 i RaTG13 istnieją liczne różnice w mutacjach punktowych, odkryto tylko jedną insercję i odmienność przekraczającą 3 nukleotydy (nt): 12-nukleotydową insercję kodującą cztery aminokwasy (aa 681-684, PRRA) w białku S SARS-CoV-2. Ten polibazowy FCS odróżnia SARS-CoV-2 od innych betakoronawirusów linii b lub innych sarbekowirusów (3). Dodatek FCS zwiększał zakaźność wirusa SARS Co-V-2 w 2019 roku (4). Brak tego FCS powoduje powstanie atenuowanych wariantów SARS-CoV-2 przydatnych do szczepień na zwierzętach, co podkreśla jego znaczenie w zakażeniach u ludzi (5). Opisywany FCS jest niezbędny do przenoszenia wirusa u ludzi i fretek (6), zwiększa tropizm wirusa do komórek ludzkich (7) i jest niezbędny do wystąpienia ciężkiej choroby w dwóch zwierzęcych modelach SARS-CoV-2 (8).

 

Białko SARS-CoV-2 Spike i MSH3

Osobliwą cechą sekwencji nukleotydowej kodującej miejsce rozszczepienia furyny PRRA w białku SARS-CoV-2 są dwa kolejne kodony CGG. Ten kodon argininy jest rzadko spotykany w koronawirusach: względne synonimiczne użycie kodonów (RSCU) CGG w CoV pangolina wynosi 0, w CoV nietoperza 0,08, w SARS-CoV 0,19, w MERS-CoV 0,25, a w SARS-CoV-2 0,299 (9).

Wyszukiwanie metodą BLAST dla 12-nukleotydowej insercji doprowadziło nas do 100% odwrotnego dopasowania w sekwencji zastrzeżonej (SEQ ID11652, nt 2751-2733) znalezionej w patencie USA 9,587,003 zgłoszonym 4 lutego 2016 (10) (Ryc. 1). Badanie SEQ ID11652 ujawniło, że dopasowanie wykracza poza 12-nukleotydową wstawkę i obejmuje sekwencję 19-nukleotydową: 5′-CTACGTGCCCGCCGAGGAG-3′ (nt 2733-2751 z SEQ ID11652), tak że powstałe mRNA miałoby 3′- GAUGCACGGCGCUCCUC-5′, lub równoważnie 5′- CU CCU CGG CGG GCA CGU AG-3′ (nukleotydy 23547-23565 w genomie SARS-CoV-2, w którym cztery pogrubione kodony dają PRRA, aminokwasy 681-684 białka szpiku). Jest to bardzo rzadkie zjawisko w bazie danych NCBI BLAST.

 

Rycina 1. Pochodzenie sekwencji furinowej w SARS-CoV-2. Porównanie sekwencji białek na styku S1/S2 w SARS-CoV, RaTG13 i SARS-CoV-2 wykazujące obecność miejsca rozszczepienia furiny (FCS) PRRA tylko w SARS-CoV-2. W oparciu o wyszukiwanie metodą BLAST 12-nukleotydowego odcinka kodującego FCS PRRA, zidentyfikowano identyczną sekwencję o długości 19-nukleotydów w opatentowanej (US 958 7003) sekwencji Seq ID11652. SEQ ID11652 jest transkrybowana do mRNA MSH3, które wydaje się być zoptymalizowane kodonowo dla człowieka. Ta 19-nukleotydowa sekwencja, w tym 12 nukleotydów kodujących FCS PRRA, obecna w ludzkim genie MSH3 mogła zostać wprowadzona do genomu SARS-CoV-2 za pomocą przedstawionego mechanizmu rekombinacji z wyborem kopii w ludzkich komórkach zakażonych SARS-CoV-2, w których dochodzi do nadekspresji genu MSH3.

 

Korelacja między tą sekwencją SARS-CoV-2 a odwrotnym uzupełnieniem zastrzeżonej sekwencji mRNA jest niepewnego pochodzenia. Konwencjonalna analiza biostatystyczna wskazuje, że prawdopodobieństwo przypadkowej obecności tej sekwencji w 30 000-nukleotydowym genomie wirusowym wynosi 3,21 ×10-11 (ryc. 2).

 

Rysunek 2. Obliczenia prawdopodobieństwa naturalnego występowania badanej sekwencji 19nt. Genom SARS-CoV-2 ma długość ~30 000 nukleotydów (P1). Sekwencja opatentowana ma długość ~3 300 nukleotydów (P2). Biblioteka opatentowana obejmuje 24'712 sekwencji o różnej długości, przy czym mediana długości wynosi 3 300 nukleotydów. Podano konwencjonalne obliczenia prawdopodobieństwa obecności sekwencji 19-nukleotydowej w genomie ludzkim i w jednej z sekwencji opatentowanej biblioteki.

 

Zastrzeżona sekwencja SEQ ID11652, odczytywana w kierunku do przodu, koduje 100% aminokwasową zgodność z ludzkim mut S homolog 3 (MSH3) (9). MSH3 jest białkiem naprawczym niedopasowania DNA (część kompleksu MutS beta) (11). SEQ ID11652 jest transkrybowany do mRNA MSH3, które wydaje się być zoptymalizowane kodonowo dla człowieka (12). Nie znaleźliśmy 19-nukleotydowej sekwencji CTCCTCGGCGGCACGTAG w żadnym genomie eukariotycznym ani wirusowym, z wyjątkiem SARS-CoV-2 o 100% pokryciu i identyczności w bazie danych BLAST (Tabele uzupełniające 1-3).

 

Dyskusja

Zastąpienie MSH3 sekwencją mRNA zoptymalizowaną pod względem kodonów do ekspresji u ludzi ma prawdopodobnie zastosowanie w nowotworach z niedoborami naprawy niedopasowania. Podczas gdy część odwrotnej sekwencji dopełniacza występująca w SARS-CoV-2 może być przypadkowym zbiegiem okoliczności, należy rozważyć inne możliwości.

Wiadomo, że nadekspresja MSH3 zakłóca naprawę niedopasowania (sekwestracja MSH2 z kompleksu MutS alfa, w skład którego wchodzą MSH2 i MSH6, powoduje degradację MSH6 i wyczerpanie MutS alfa) (13), co ma znaczenie wirusologiczne. Indukcja niedoboru naprawy niedopasowania DNA skutkuje permisywnością zakażenia wirusem grypy A (IAV) ludzkich komórek układu oddechowego i zwiększoną patogennością (14). Niedobór naprawy niedopasowania może przedłużać wydalanie wirusa SARS-CoV-2 (15, 16).

Brak CTCCTCTCGGCGGCACGTAG w jakimkolwiek genomie eukariotycznym lub wirusowym w bazie danych BLAST sprawia, że rekombinacja w żywicielu pośrednim jest mało prawdopodobnym wyjaśnieniem jego obecności w SARS-CoV-2. Zoptymalizowany pod kątem ludzkich kodonów mRNA kodujący białko w 100% homologiczne do ludzkiego MSH3 mógłby, podczas badań nad wirusami, nieumyślnie lub celowo wywołać niedobór naprawy niedopasowania w ludzkiej linii komórkowej, co zwiększyłoby podatność na infekcję wirusem podobnym do SARS. Zakażenie ludzkich komórek transdukowanych SEQ ID11652-MSH3 wirusem podobnym do SARS mogłoby umożliwić rekombinację z wyborem kopii (15). Replikacja SARS-CoV-2 i innych jednoniciowych wirusów RNA z genomem RNA o dodatniej polarności jest inicjowana przez syntezę RNA o ujemnej nici w cytoplazmie zakażonych komórek (17) (Rysunek 1). Ujemna nić RNA stanowi szablon do syntezy dodatniej nici RNA wykorzystywanej do translacji białek niestrukturalnych, kompleksu replikacyjno-skrypcyjnego lub nowych kapsydów wirusa. Koronawirusy wytwarzają dwuniciowe RNA na wczesnym etapie zakażenia poprzez replikację genomu i transkrypcję mRNA (18).

Nabycie sekwencji FCS o odwrotnym dopełnieniu z nadekspresyjnego mRNA MSH3 o dodatnim sensie może nastąpić w wyniku rekombinacji z wyboru kopii z pośrednim RNA SARS-CoV-2 o ujemnej wartości (15), co wiąże się z przeskakiwaniem z jednego szablonu na drugi (19) (rysunek 1). Homologia między SARS-CoV-2 i innymi znanymi koronawirusami jest przerwana, a większość sekwencji SARS-CoV-2 pochodzi od stosunkowo niedawnego wspólnego przodka z nietoperzem RaTG13. Co więcej, wykresy podobieństwa (SimPlots) zidentyfikowały nagłe zmiany w identyczności sekwencji między SARS-CoV-2 i RaTG13, sygnalizujące potencjalne zdarzenia rekombinacyjne, co mogłoby wyjaśnić zdolność SARS-CoV-2 do wiązania się z ACE2 poprzez RBD, co nie występuje w przypadku RBD RaTG13 (15).

Krytyka tej hipotezy polega na tym, że zidentyfikowana sekwencja znajduje się po przeciwnej stronie otwartej ramki odczytu w SEQ ID11652. Jednakże, komórki transfekowane MSH3, które indukują niedobór naprawy niedopasowania, mogły skierować dwuniciowe cDNA kodujące SEQ ID11652. Takie komórki poddane współtransfekcji z wirusem podobnym do SARS, wykazującym ekspresję RdRp, mogły przyłączyć się do tej 19-nukleotydowej sekwencji (15) i umożliwić integrację fragmentu z nici ujemnej do genomu wirusowego, w tym FCS, mimo że znajdował się on na przeciwnej nici otwartej ramki odczytu. Mechanizmy naprawy niedopasowania umożliwiły integrację krótkich fragmentów z nici antysensowych w modelach eksperymentalnych (20, 21). Mikrohomologia może kierować rekombinacją między MSH3 a wirusem podobnym do SARS, co może mieć miejsce w interesującej nas sekwencji 19-nukleotydowej.

 

 Obecność w SARS-CoV-2 19-nukleotydowej sekwencji RNA kodującej FCS w aminokwasie 681 jego białka spike o 100% identyczności z odwrotnym dopełnieniem sekwencji mRNA MSH3 jest wysoce niezwykła. Należy dokładniej zbadać potencjalne wyjaśnienia tej korelacji.

Oświadczenie o dostępności danych

W tym badaniu przeanalizowano publicznie dostępne zestawy danych. Dane te można znaleźć tutaj: SEQ ID11652.

 

Wkład autorów

Badanie i pierwotny projekt zostały zainicjowane przez BA, AV i AB. Wizualizacja została wykonana przez BA, AV, AB i GP. Artykuł napisali i zredagowali: BA, AV, KL, GP, BU, VU i AB. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania artykułu i zatwierdzili przedłożoną wersję.

 

Konflikt interesów

Kenneth Lundstrom był zatrudniony w firmie PanTherapeutics. Pozostali autorzy deklarują, że badania były prowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych powiązań, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

 

Nota wydawcy

Wszystkie opinie wyrażone w tym artykule są wyłącznie opiniami autorów i nie muszą reprezentować opinii organizacji z nimi związanych, wydawcy, redaktorów i recenzentów. Wydawca nie gwarantuje ani nie popiera żadnego produktu, który może być oceniany w tym artykule, ani twierdzenia jego producenta.

 

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Jianowi Yingowi z Uniwersytetu Utah w Eureka (USA) za jego wkład w analizę prawdopodobieństwa.

 

Materiały uzupełniające

Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć w Internecie pod adresem: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fviro.2022.834808/full#supplementary-material

 

Przypisy

1.      Garushyants SK, Rogozin IB, Koonin EV. Template switching and duplications in SARS-CoV-2 genomes give rise to insertion variants that merit monitoring. Commun Biol. (2021) 4:1343. doi: 10.1038/s42003-021-02858-9

2.      Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. (2020) 579:265–9. doi: 10.1038/s41586-020-2008-3

3.      Coutard B, Valle C, de Lamballerie X, Canard B, Seidah NG, Decroly E. The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade. Antiviral Res. (2020) 176:104742. doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104742

4.      Walls AC, Park YJ, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. (2020) 181:281–92.e286. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058

5.      Lau SY, Wang P, Mok BWY, Zhang AJ, Chu H, Lee ACY, et al. Attenuated SARS-CoV-2 variants with deletions at the S1/S2 junction. Emerg Microbes Infect. (2020) 9:837–42. doi: 10.1080/22221751.2020.1756700

6.      Peacock TP, Goldhill DH, Zhou J, Baillon L, Frise R, Swann OC, et al. The furin cleavage site in the SARS-CoV-2 spike protein is required for transmission in ferrets. Nat Microbiol. (2020) 6:899–909. doi: 10.1038/s41564-021-00908-w

7.      Xia S, Lan Q, Su S, Wang X, Xu W, Liu Z, et al. The role of furin cleavage site in SARS-CoV-2 spike protein-mediated membrane fusion in the presence or absence of trypsin. Signal Transd. Targeted Ther. (2020) 5:92. doi: 10.1038/s41392-020-0184-0

8.      Hou W. Characterization of codon usage pattern in SARS-CoV-2. Virology J. (2020) 17:138. doi: 10.1186/s12985-020-01395-x

9.      Kandeel M, Ibrahim A, Fayez M, Al-Nazawi M. From SARS and MERS CoVs to SARS-CoV-2: Moving toward more biased codon usage in viral structural and nonstructural genes. J Med Virol. (2020) 92:660–6. doi: 10.1002/jmv.25754

10.  Bancel S, Chakraborty T, De Fougerolles A, Elbashir SM, John M, Roy A, et al. Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides. Cambridge, MA: United States Patent. (2016).

11.  MacRae SL, McKnight Croken M, Calder RB, Aliper A, Milholland B, White RR, et al. DNA repair in species with extreme lifespan differences. Aging. (2015) 7:1171–84. doi: 10.18632/aging.100866

12.  Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. (2014) 20:604–13. doi: 10.1016/j.molmed.2014.09.003

13.  Marra G, Iaccarino I, Lettieri T, Roscilli G, Delmastro P, Jiricny J. Mismatch repair deficiency associated with overexpression of the MSH3 gene. Proc Natl Acad Sci USA. (1998) 95:8568. doi: 10.1073/pnas.95.15.8568

14.  Chambers BS, Heaton BE, Rausch K, Dumm RE, Hamilton JR, Cherry S, et al. DNA mismatch repair is required for the host innate response and controls cellular fate after influenza virus infection. Nat Microbiol. (2019) 4:1964–77. doi: 10.1038/s41564-019-0509-3

15.  Gallaher WR. A palindromic RNA sequence as a common breakpoint contributor to copy-choice recombination in SARS-COV-2. Arch Virol. (2020) 165:2341–8. doi: 10.1007/s00705-020-04750-z

16.  Haque F, Lillie P, Haque F, Maraveyas A. Deficient DNA mismatch repair and persistence of SARS-CoV-2 RNA shedding: a case report of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer with COVID-19 infection. BMC Infect Dis. (2020) 21:854. doi: 10.1186/s12879-021-06500-1

17.  V'kovski P, Kratzel A, Steiner S, Stalder H, Thiel V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev. (2021) 19:155–70. doi: 10.1038/s41579-020-00468-6

18.  Graham RL, Baric RS. Recombination, reservoirs, and the modular spike: mechanisms of coronavirus cross-species transmission. J Virol. (2010) 84:3146. doi: 10.1128/JVI.01394-09

19.  Sola I, Almazan F, Zuniga S, Enjuanes L. Continuous and discontinuous RNA synthesis in coronaviruses. Annu Rev Virol. (2015) 2:265–88. doi: 10.1146/annurev-virology-100114-055218

20.  Rakosy-Tican E, Lörincz-Besenyei E, Molnár I, Thieme R, Hartung F, Sprink T, et al. New Phenotypes of potato co-induced by mismatch repair deficiency and somatic hybridization. Front Plant Sci. (2019) 10:3. doi: 10.3389/fpls.2019.00003

21.  Harmsen T, Klaasen S, van de Vrugt H, te Riele H. DNA mismatch repair and oligonucleotide end-protection promote base-pair substitution distal from a CRISPR/Cas9- induced DNA break. Nucl Acids Res. (2018) 46:2945–55. doi: 10.1093/nar/gky076